عنوان مقاله: تشخیص مولکولی غیر کشنده باکتری Streptococcus agalactiae در ماهی قزل‌آلای رنگین کمان

نویسندگان:

مهرنوش فرید¹، علیرضا میرواقفی²، حمید فرحمند²، محمد علی نعمت الهی³

1- دانش آموخته کارشناسی ارشد گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه تهران

2- استاد، گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه تهران

3- دانشیار، گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه تهران

چکیده:

بیماری استرپتوکوکوزیس به دلیل شیوع سریع به‌ویژه در فصل تابستان، مرگ و میر نسبتا بالا، کاهش تولید و خسارات اقتصادی به آبزی‌پروری یکی از مهمترین بیماری‌های باکتریایی در ماهیان سردآبی است. تشخیص به موقع بیماری در پیشگیری از همه‌گیری و اقدامات درمانی بسیار ضروری می‌باشد. نمونه برداری به صورت Non-destructive از خون و موکوس ماهی یکی از بهترین روش‌های تشخیصی می‌باشد که بدون نیاز به تلف کردن ماهی بیماری تشخیص داده می‌شود.

در این بررسی شناسایی باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه در ماهی قزل‌آلای رنگین کمان انجام شده است که با وجود بیماری‌زایی بالای این باکتری، کمتر مورد بررسی قرار گرفته است. برای این بررسی از خون و موکوس ماهیان قزل‌آلای رنگین کمان برداشت گردید و تشخیص مولکولی توسط پی‌سی‌آر انجام گردید. در بررسی مولکولی DNA موکوس و خون به طور مستقیم استخراج و وارد چرخه پی‌سی‌آر گردید. برای PCR از پرایمر طراحی شده بر پایه ژن scpB استفاده گردید که برای این جنس اختصاصی می‌باشد و از حساسیت بالایی برای تشخیص این گونه برخوردار است.

نتایج نشان داد که در خون ماهیان قبل از بروز علائم بیماری می‌توان با استفاده از روش مولکولی باکتری را تشخیص داد اما در موکوس ماهیان باکتری مورد نظر یافت نشد. می‌توان با استفاده از این روش بیماری باکتریایی در حال گسترش در ماهیان مولد و ماهیان ارزشمند را بدون نیاز به تلف کردن ماهی تشخیص داد و به درمان آن پرداخت.

واژگان کلیدی: روش تشخیص مولکولی، پی‌سی‌آر، خون، موکوس، بیماری

مقدمه:

باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه یکی از باکتری‌های مهم بیماری‌زا در میان ماهیان آب شیرین، شور و لب‌شور می‌باشد که بیماری و مرگ و میر را در ماهیان ایجاد می‌کند. این گونه می‌تواند ماهی‌های زیادی از جمله تیلاپیا، مولت، شاینر طلائی، منهدن، گود و بالمینو را آلوده سازد. همه‌گیری این بیماری با مرگ‌و‌میر بالا به چندین عامل از جمله بالا رفتن دمای آب، افزایش سطح آمونیاک و کم شدن اکسیژن محلول مربوط می‌باشد.

علائم بیماری شامل بی‌اشتهایی، قرار گرفتن بدن به صورت C، شنای نامنظم، بیرون‌زدگی چشم و آسیت می‌باشد. این گونه می‌تواند موجب سپتی سمی در تیلاپیا گردد و بر روی مغز، کلیه و دستگاه گوارش اثر گذار باشد. از شایع‌ترین علائم این بیماری می‌توان بی‌اشتهایی، بیرون‌زدگی چشم، تجمع مایع در حفره شکمی و شنای نامنظم را نام برد.

در دهه گذشته مطالعات بسیار زیادی بر روی تشخیص بیماری‌های باکتریایی با استفاده از پروتکل پی‌سی‌آر انجام پذیرفته است. اساس اکثر این بررسی‌ها بر شناسایی ژن 16SrRNA بوده است و با نتایج قابل قبولی همراه نبوده است. بیشتر روش‌های تشخیصی پاتوژن برای برداشت نمونه نیاز به کشتن ماهی دارد، اما در این بررسی تشخیصی بدون نیاز به تلف ساختن ماهی نمونه‌برداری از خون و موکوس صورت پذیرفته است. این نوع روش برای تشخیص بیماری مخصوصاً در مورد ماهیان مولد و ماهیان ارزشمند روشی سودمند می‌باشد.

ژن scpB توسط دیمیتریو و همکاران برای بررسی نمونه‌های انسانی معرفی گردید و با آن شناسایی باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه به خوبی انجام پذیرفت. این ژن نقش مهمی در تولید پروتئین C5a دارا می‌باشد که نقش آن در چسبیدن به سلول اپیتلیال می‌باشد و به طور مستقیم با بیماری‌زایی باکتری در ارتباط می‌باشد.

بنابراین هدف این بررسی ایجاد روش پی‌سی‌آر با استفاده از پرایمرهای جدید برای تشخیص سریع و اختصاصی باکتری بدون تلف‌سازی ماهی می‌باشد.

مواد و روش‌ها:

1- تهیه ماهی

تعداد 60 عدد ماهی قزل‌آلای رنگین کمان از ماهی سرای کرج خریداری شد و به دانشکده منابع طبیعی دانشگاه تهران منتقل گردید. ماهیان متوسط وزن 230 ± 20 گرم را دارا بودند. ماهیان در 6 مخزن 1000 لیتری حاوی آب شهری کلرزدایی شده جای گرفتند. دوره روشنایی به تاریکی 12 ساعت به 12 ساعت بود. ماهیان روزانه توسط بیومار شرکت بهپرور (کرج-ایران) غذادهی شدند. میانگین دمای آب تانک‌ها 17 درجه سانتیگراد ثبت گردید.

2- سویه باکتری و شرایط کشت

باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه با شناسه RTCC2051 از موسسه سرم‌سازی رازی تهیه گردید. برای کشت باکتری محیط کشت بلاد آگار 5 درصد از شرکت دارواش خریداری شد. سپس از محیط کشت اولیه کلونی‌ها برداشت و به‌صورت خطی بر روی محیط کشت بلاد آگار کشت داده شد و برای مدت 24 ساعت در داخل انکوباتور با دمای 37 درجه قرار داده شدند. برای تهیه مخزن باکتری، کلونی باکتری در محیط کشت BHI که حاوی 20 درصد گلیسرول بود حل گردید. پس از تهیه، محلول در دمای 80 – قرار داده شد.

برای تعیین دوز تزریقی از مخزن باکتری بر روی محیط بلاد آگار به صورت خطی کشت داده شده و داخل انکوباتور 37 درجه قرار داده شد. پس از گذشت 24 ساعت کلونی‌های باکتری که رشد کرده‌اند برداشته شده و در سرم فیزیولوژی حل گردیدند و از محلول به دست آمده میزان 100 ماکرولیتر بر روی محیط‌های کشت تازه ریخته شد و دوباره به صورت کامل بر روی سطح محیط کشت پخش گردید.

برای تعیین CFU از باکتری دوبار کشت داده شده بر روی محیط کشت بلاد آگار استفاده گردید و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر کدورت سنجیده شد. در جذب 623 نانومتر، برای کدورت عدد 0/2 خوانده شد و بر این اساس میزان CFU باکتری برابر با 1.9 × 8 محاسبه گردید.

3- تزریق ماهیان

برای تزریق باکتری این میزان CFU را به میزان 100 برابر رقیق کرده و محلولی با میزان CFU 710 × 8 برای تزریق به ماهیان آماده شد. ماهیان در ظرف حاوی گل میخک بیهوش گردیده و تزریق به صورت داخل صفاقی به میزان 0/1 سی‌سی انجام پذیرفت. به ماهیان شاهد نیز به میزان 0/1 سی‌سی سرم فیزیولوژی استریل تزریق گردید.

4- نمونه‌برداری غیر کشنده

از ماهیان 24 ساعت پس از تزریق با فاصله زمانی 24 ساعته نمونه‌برداری انجام پذیرفت. میزان یک سی‌سی خون از ناحیه دم ماهیان برداشت و داخل لوله حاوی EDTA ریخته شد. خون گرفته شده تا هنگام بررسی و استخراج DNA در دمای 70 – نگهداری شدند. موکوس نیز توسط کشیدن لام بر روی بدن ماهی در جهت فلس‌ها برداشت شد. سپس از روی لام به داخل میکروتیوپ ریخته شده و برای جلوگیری از لیز شدن نمونه توسط آنزیم‌های موجود در موکوس، نمونه‌ها بر روی یخ جابجا شدند و سریعاً به دمای 70 – منتقل گردیدند.

5- استخراج DNA

برای استخراج DNA از خون از کیت خون Cinnapure DNA KIT و برای موکوس از روش فنل و کلروفرم استفاده گردید. پس از استخراج، DNA تا زمان بررسی در دمای 20 – قرار داده شد. به منظور استخراج DNA از باکتری، برای مدت 10 دقیقه به میکروتیوپ حرارت 96 درجه وارد گردید تا DNA استخراج گردد. پس از گذشت 10 دقیقه میکروتیوپ از داخل دستگاه برداشته شده و برای نگهداری به دمای 70 – انتقال یافتند.

6- توالی‌یابی محصول پی‌سی‌آر

برای توالی‌یابی، محصول پی‌سی‌آر به شرکت فزاپژوه فرستاده شد. برای بررسی توالی محصول پی‌سی‌آر از نرم افزار BLAST استفاده و توالی دریافتی مورد بررسی قرار گرفت و صحت آن ارزیابی شد. با این بررسی از چسبیدن درست پرایمر به جایگاه ژنی scpB در باکتری اطمینان حاصل گردید.

7- روش آماری

پس از اطمینان از نرمال بودن داده‌ها، برای بررسی تأثیر تیمارها و زمان نگهداری از طرح کاملاً تصادفی و تجزیه واریانس یک طرفه (One-way ANOVA) استفاده شد. در صورت وجود اختلاف معنی‌دار بین تیمارها از آزمون دانکن در سطح معنی‌دار 5 درصد استفاده شد. تجزیه تحلیل آماری داده‌های حاصله با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 21 انجام شد.

نتایج

1- علائم و تلفات ماهیان پس از تزریق باکتری

از روز ششم پس از تزریق علائم بیماری ظاهر گردید. این علائم شامل زخم در باله دمی، خونریزی در قاعده باله‌ها، تیرگی رنگ بدن، اگزوفتالمی یک‌طرفه و دوطرفه و شنای نامنظم و علائم داخلی بدن ماهی شامل رنگ‌پریدگی کبد و خونریزی داخلی و تورم اندام‌ها گوارشی بودند.

2- پی‌سی‌آر نمونه‌های غیر مخرب

در بررسی نمونه‌های خون بر روی ژل در نمونه‌های برداشتی از روز سوم پس از تزریق، باندهای حاصل از وجود ژن scpB در محدوده 245bp دیده شد که نشان دهنده وجود باکتری در نمونه خون مورد بررسی می‌باشد. برای یافتن باکتری بر روی موکوس از DNA نمونه‌های موکوس برای واکنش پی‌سی‌آر برداشت شد. نتایج حاصل از استخراج DNA هیچ‌گونه DNA استخراج شده‌ای را به ما نشان نداد. اما برای اطمینان از نبود باکتری پی‌سی‌آر انجام گردید. در نمونه‌ها باندی مبنی بر وجود باکتری استرپتوکوکوس اگالاکتیه دیده نشد.

3- توالی‌یابی محصول پی‌سی‌آر

نتایج توالی‌یابی نشان داد که محصول پی‌سی‌آر مربوط به سویه RTCC_2051 می‌باشد که باکتری مورد نظر ما در این بررسی می‌باشد. توالی مربوط به ژن پپتیداز (C5a(scpB است و با Accession number شماره JF831508.1 موجود می‌باشد. این نتایج نشان می‌دهد پرایمر طراحی شده و استفاده شده در این بررسی به قطعه مورد نظر در ژنوم باکتری چسبیده است.

بحث و نتیجه‌گیری:

تکنیک پی‌سی‌آر به عنوان روش تشخیصی مولکولی امروزه در حال گسترش است. استفاده از پرایمرهای عمومی همانند 16SrRNA به علت در دسترس بودن و حفاظت شدگی بالا در گونه‌ها مورد استفاده می‌باشند. اما تشخیص توسط این پرایمرها بایستی با قدم‌های بعدی شامل توالی‌یابی و برش‌های آنزیمی اختصاصی‌تر شوند. زیرا به همراه نکات مثبتی که در این گونه پرایمرها وجود دارد، به علت اینکه احتمال ریسک نتایج مثبت اشتباه را بالا می‌برند و می‌توانند به گستره وسیعی از باکتری‌ها و انگل‌ها بچسبند، مورد اعتماد کامل نیستند.

بر اساس نتایج این تحقیق می‌توان بیان داشت که استفاده از این محدوده ژنی در بین جمعیت ماهیان مولد و نیز ماهیان در خطر انقراض حائز اهمیت می‌باشد و با استفاده از این تکنولوژی می‌توان از همه‌گیری بیماری در جمعیت این ماهیان جلوگیری کرد.

برای محصولات و بسته‌های آموزشی مرتبط با آبزیان بر روی لینک زیر کلیک بفرمایید. آبزیان (ماهیان گرم آبی، ماهیان سرد آبی، آکواریومی، ماهیان زینتی و …)